Подготовка больших биологических образцов для высоких

Протоколы природы, том 18, страницы 1441–1461 (2023 г.) Процитировать эту статью

1712 Доступов

1 Цитаты

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Визуализация в различных масштабах необходима для понимания морфологии здоровых органов и патофизиологических изменений. Макро- и микромасштабная трехмерная морфология крупных образцов, в том числе интактных органов человека, возможна с помощью рентгеновской микротомографии (с использованием лабораторных или синхротронных источников). Однако подготовка больших образцов для визуализации с высоким разрешением является сложной задачей из-за таких ограничений, как усадка образца, недостаточный контраст, движение образца и образование пузырьков во время монтажа или сканирования. Здесь мы описываем подготовку, стабилизацию, обезвоживание и монтаж больших образцов мягких тканей для рентгеновской микротомографии. Мы подробно описываем протокол, применяемый к целым человеческим органам и иерархической фазово-контрастной томографии в Европейской установке синхротронного излучения, но он применим к ряду биологических образцов, включая целые организмы. Протокол повышает контрастность при использовании рентгеновских изображений, предотвращая при этом движение образца во время сканирования, даже при различной ориентации образца. Пузырьки, захваченные во время монтажа, и те, которые образуются во время сканирования (в случае синхротронной рентгеновской визуализации), уменьшаются за счет нескольких этапов дегазации. Подготовка проб также совместима с магнитно-резонансной томографией, компьютерной томографией и гистологическим наблюдением. Подготовка и установка образца требуют 24–36 дней для большого органа, такого как целый человеческий мозг или сердце. Время подготовки варьируется в зависимости от состава, размера и хрупкости ткани. Использование протокола позволяет сканировать интактные органы диаметром 150 мм с размером локального вокселя 1 мкм. Протокол требует от пользователей опыта работы с органами человека или животных, лабораторных работ и рентгеновской визуализации.

Количественная оценка морфологии органов человека, как в здоровом состоянии, так и при заболевании, представляет собой сложную задачу, которую можно решить с помощью мультимодальных методов пространственной визуализации, способных охватывать различные масштабы измерений. Полная морфологическая характеристика тканей требует выявления взаимодействий между масштабами; однако большинство методов визуализации ограничены либо разрешением, либо полем зрения, что затрудняет объединение макроскопических и микроскопических наблюдений и данных. Обычные подходы к гистологии1,2,3 или электронной микроскопии4,5,6 позволяют визуализировать микроструктурную организацию и состав ткани с помощью серийных срезов, а данные можно соответствующим образом оценить количественно; однако эти подходы обычно требуют отбора проб и секционирования ткани и являются чрезвычайно трудоемкими и отнимают много времени. Оптическая очистка в сочетании со световой листовой микроскопией может обеспечить большое поле зрения с высоким разрешением; однако очистка тканей также требует больших временных затрат и часто является дорогостоящей; кроме того, глубина изображения светового микроскопа ограничена рабочим расстоянием объектива7,8. Даже если целые органы взрослого человека8 или целые животные9 были очищены в течение нескольких месяцев, их визуализация остается сложной задачей. Аналогичные недостатки присущи оптической когерентной томографии10,11, многофотонной микроскопии12 или конфокальной микроскопии13,14, которые могут фиксировать локальную трехмерную (3D) микроструктуру ткани в клеточном масштабе, но имеют ограниченное проникновение в ткань, что затрудняет визуализацию глубоких тканей15. Недавно с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) высокого разрешения удалось достичь размера изотропных вокселей 100 мкм во всем человеческом мозге ex vivo16. Хотя МРТ является неразрушающим методом и имеет большое поле зрения17, разрешения все же недостаточно для изучения микроструктуры тканей. Методы иерархической визуализации способны преодолеть компромисс между разрешением и полем зрения. При иерархическом подходе несколько изображений одного и того же образца получаются с разным разрешением, чтобы соединить разные масштабы. Микрокомпьютерная томография (мкКТ) использовалась для изображения всех легких с разрешением вокселей 150 мкм с последующим извлечением ядер биопсии из легких; эти небольшие ядра затем были просканированы с помощью микроКТ для получения вокселей размером 10 мкм18.